Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) on cell viability and gene expression related to neurite outgrowth in human neural stem cells undergoing differentiation

Abstract

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are widespread environmental pollutants formed under incomplete combustions of organic materials such as the burning of fossil fuels, domestic heating, automobile exhaust, cooking, and tobacco smoke. Some of the PAHs, like benzo[a]pyrene (B[a]P), are known for their carcinogenic, genotoxic, and reproductive toxic properties. Furthermore, concerns have been raised about the impact of PAHs on neurodevelopment and possibly neurodevelopmental disorders, since accumulating evidence in both animal and epidemiological studies points in the direction that PAH exposure can lead to adverse effects on the developing brain. PAHs are lipophilic compounds and when inhaled they can readily pass the placenta omitting the first path elimination in the liver. The fetus is therefore at high risk due to limited protection by an immature blood-brain barrier and because of the highly vulnerable dynamic complex processes during neurodevelopment. In this thesis, neural stem cells derived from human induced pluripotent stem cells were used. This model can mimic key neurodevelopmental differentiation processes, vital for normal brain development, which were assessed by changes in cell viability, gene expression, and protein markers. The neural stem cells were during differentiation to a complex neuronal network exposed to a wide concentration range of three PAHs, namely B[a]P, β-naphthoflavone (β-NF), and pyrene for up to 21 days. Effects on cell viability were measured with Alamar Blue™ Cell Viability assay after exposure for 1, 3, 14, and 21 days. Changes in expression of genes related to neurodevelopment were evaluated with real-time PCR after exposure for 3, 14, and 21 days. Protein markers were qualitatively investigated with immunocytochemistry and high content imaging after 14 and 21 days of exposure. The culture and differentiation processes developed as expected, determined by changes in morphology and gene expression in addition to the protein markers. Exposure to low concentrations of β-NF and pyrene increased cell viability, while higher concentrations of particular B[a]P caused cytotoxicity. Minor alternations were found in gene expression, and only one gene was statistically significantly changed upon exposure. Expression of the astrocyte marker GFAP was unexpectedly not detected. Protein expression of markers related to neurodevelopment was only qualitative and did not reveal any visible differences after PAH exposure up to 21 days. In conclusion, exposure to the PAHs increased cell viability at nanomolar concentrations of β-NF and pyrene, whereas micromolar concentrations of B[a]P caused a decrease. The neurite outgrowth marker GAP43 was statistically significantly increased after 21 days of exposure to the three PAHs. No visible alterations in protein markers for neurodevelopment processes were observed.

Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAHer) er en stor gruppe av miljøforurensende stoffer/kjemikalier som dannes under ufullstendig forbrenning av organisk materiale. Utslipp ses i sammenheng med husholdningsoppvarming, bileksos, matlagning og tobakksrøyk. Noen PAHer, som benzo[a]pyren (B[a]P), er kjent for sin kreftfremkallende, gentoksiske og reproduksjonstoksiske egenskaper. Bekymring rundt mulige nevroutviklingsforstyrrelser indusert av PAHer, har blitt utrykt, etter akkumulerende bevis i både dyrestudier og epidemiologiske studier. PAHer er fettløselige forbindelser, og når de inhaleres, kan de passere morkaken og unngå første linje-elimineringen i leveren. Fosteret har derfor høy risiko for eksponeringen som følge av den umodne blodhjerne-barrieren og de svært sårbare og dynamiske prosessene under nevroutvikling. I denne oppgaven ble nevrale stamceller utviklet fra human induserte pluripotente stamceller benyttet. Cellemodellen kan etterligne viktige prosesser i human nevroutvikling/hjerneutvikling og mulig endringer i slike prosesser ble undersøkt ved bruk av viabilitetsstudier, genuttrykk og proteinmarkører. Nevrale stamceller ble, under differensiering, til et komplekst nettverk av nevroner eksponert for ulike konsentrasjoner av PAHer i opptil 21 dager. PAHer som ble benyttet var B[a]P, β-naftoflavon (β-NF) og pyrene. Effekter på celleviabilitet ble målt med Alamar Blue™ etter eksponering i 1, 3, 14 og 21 dager. Endring i genuttrykk ble analysert med sanntids-PCR etter eksponering i 3, 14 og 21 dager. Proteinmarkører ble undersøkt kvalitativt med immuncytokjemi og visualisert med høyoppløselighetbilledtakning etter eksponering i 14 og 21 dager. Cellekulturen og differensieringsprosessen utviklet seg som forventet, som vist ved endringer i morfologi, genuttrykk og forekomst av proteinmarkører. Eksponering for lave konsentrasjoner av β-NF og pyren førte til en økning i celleviabilitet, mens høye konsentrasjoner av særlig B[a]P forårsaket cytotoksisitet. Mindre endringer ble funnet i genuttrykk, og kun et gen var statistisk signifikant endret etter eksponering. Genuttrykk av GFAP ble ikke funnet og bør videre undersøkes. Proteinutrykk av markører relatert til nevroutvikling og morfologi var kun kvalitativt vurdert, og ingen åpenbare forskjeller ble funnet etter PAH-eksponering i opptil 21 dager. Det konkluderes med at PAH-eksponering av nanomolare konsentrasjoner av β-NF og pyren økte celleviabiliteten, mens mikromolare konsentrasjoner av den mulige kreftfremkallende PAH-forbindelsen B[a]P forårsaket en reduksjon. Nevrittutvekstmarkøren GAP43 ble statistisk signifikant økt etter 21 dager eksponering. Ingen åpenbare endringer i proteinutrykk ble observert.