Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) on cell viability and gene expression related to neurite outgrowth in human neural stem cells undergoing differentiation
Abstract
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are widespread environmental pollutants formed
under incomplete combustions of organic materials such as the burning of fossil fuels, domestic
heating, automobile exhaust, cooking, and tobacco smoke. Some of the PAHs, like
benzo[a]pyrene (B[a]P), are known for their carcinogenic, genotoxic, and reproductive toxic
properties. Furthermore, concerns have been raised about the impact of PAHs on
neurodevelopment and possibly neurodevelopmental disorders, since accumulating evidence in
both animal and epidemiological studies points in the direction that PAH exposure can lead to
adverse effects on the developing brain. PAHs are lipophilic compounds and when inhaled they
can readily pass the placenta omitting the first path elimination in the liver. The fetus is therefore
at high risk due to limited protection by an immature blood-brain barrier and because of the
highly vulnerable dynamic complex processes during neurodevelopment. In this thesis, neural
stem cells derived from human induced pluripotent stem cells were used. This model can mimic
key neurodevelopmental differentiation processes, vital for normal brain development, which
were assessed by changes in cell viability, gene expression, and protein markers. The neural
stem cells were during differentiation to a complex neuronal network exposed to a wide
concentration range of three PAHs, namely B[a]P, β-naphthoflavone (β-NF), and pyrene for up
to 21 days. Effects on cell viability were measured with Alamar Blue™ Cell Viability assay
after exposure for 1, 3, 14, and 21 days. Changes in expression of genes related to
neurodevelopment were evaluated with real-time PCR after exposure for 3, 14, and 21 days.
Protein markers were qualitatively investigated with immunocytochemistry and high content
imaging after 14 and 21 days of exposure. The culture and differentiation processes developed
as expected, determined by changes in morphology and gene expression in addition to the
protein markers. Exposure to low concentrations of β-NF and pyrene increased cell viability,
while higher concentrations of particular B[a]P caused cytotoxicity. Minor alternations were
found in gene expression, and only one gene was statistically significantly changed upon
exposure. Expression of the astrocyte marker GFAP was unexpectedly not detected. Protein
expression of markers related to neurodevelopment was only qualitative and did not reveal any
visible differences after PAH exposure up to 21 days. In conclusion, exposure to the PAHs
increased cell viability at nanomolar concentrations of β-NF and pyrene, whereas micromolar
concentrations of B[a]P caused a decrease. The neurite outgrowth marker GAP43 was
statistically significantly increased after 21 days of exposure to the three PAHs. No visible
alterations in protein markers for neurodevelopment processes were observed. Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAHer) er en stor gruppe av miljøforurensende
stoffer/kjemikalier som dannes under ufullstendig forbrenning av organisk materiale. Utslipp
ses i sammenheng med husholdningsoppvarming, bileksos, matlagning og tobakksrøyk. Noen
PAHer, som benzo[a]pyren (B[a]P), er kjent for sin kreftfremkallende, gentoksiske og
reproduksjonstoksiske egenskaper. Bekymring rundt mulige nevroutviklingsforstyrrelser
indusert av PAHer, har blitt utrykt, etter akkumulerende bevis i både dyrestudier og
epidemiologiske studier. PAHer er fettløselige forbindelser, og når de inhaleres, kan de passere
morkaken og unngå første linje-elimineringen i leveren. Fosteret har derfor høy risiko for
eksponeringen som følge av den umodne blodhjerne-barrieren og de svært sårbare og
dynamiske prosessene under nevroutvikling.
I denne oppgaven ble nevrale stamceller utviklet fra human induserte pluripotente stamceller
benyttet. Cellemodellen kan etterligne viktige prosesser i human nevroutvikling/hjerneutvikling
og mulig endringer i slike prosesser ble undersøkt ved bruk av viabilitetsstudier, genuttrykk og
proteinmarkører. Nevrale stamceller ble, under differensiering, til et komplekst nettverk av
nevroner eksponert for ulike konsentrasjoner av PAHer i opptil 21 dager. PAHer som ble
benyttet var B[a]P, β-naftoflavon (β-NF) og pyrene. Effekter på celleviabilitet ble målt med
Alamar Blue™ etter eksponering i 1, 3, 14 og 21 dager. Endring i genuttrykk ble analysert med
sanntids-PCR etter eksponering i 3, 14 og 21 dager. Proteinmarkører ble undersøkt kvalitativt
med immuncytokjemi og visualisert med høyoppløselighetbilledtakning etter eksponering i 14
og 21 dager. Cellekulturen og differensieringsprosessen utviklet seg som forventet, som vist
ved endringer i morfologi, genuttrykk og forekomst av proteinmarkører. Eksponering for lave
konsentrasjoner av β-NF og pyren førte til en økning i celleviabilitet, mens høye
konsentrasjoner av særlig B[a]P forårsaket cytotoksisitet. Mindre endringer ble funnet i
genuttrykk, og kun et gen var statistisk signifikant endret etter eksponering. Genuttrykk av
GFAP ble ikke funnet og bør videre undersøkes. Proteinutrykk av markører relatert til
nevroutvikling og morfologi var kun kvalitativt vurdert, og ingen åpenbare forskjeller ble
funnet etter PAH-eksponering i opptil 21 dager. Det konkluderes med at PAH-eksponering av
nanomolare konsentrasjoner av β-NF og pyren økte celleviabiliteten, mens mikromolare
konsentrasjoner av den mulige kreftfremkallende PAH-forbindelsen B[a]P forårsaket en
reduksjon. Nevrittutvekstmarkøren GAP43 ble statistisk signifikant økt etter 21 dager
eksponering. Ingen åpenbare endringer i proteinutrykk ble observert.