Karakterisering av ekstracellulære vesikler fra humane skjelettmuskelceller - effekt av elektrisk pulsstimulering

Abstract

celleblærer i nanostørrelse. Vesiklene skilles ut fra de fleste celler og er påvist i mange biologiske væsker. EV inndeles i eksosomer, mikrovesikler (MV) og apoptotiske legemer. Vesiklene gjenspeiler modercellens fysiologiske tilstand og inneholder proteiner, lipider og nukleinsyrer som kan være viktige mediatorer ved celle-celle-kommunikasjon. Antall vesikler og deres innhold kan være endret ved ulike sykdoms-tilstander, noe som gjør dem interessante som biomarkører. Det er en stigende fedmeepidemi i verden som har ført til økt forekomst av type 2-diabetes (T2DM). Regelmessig trening er vist å være forebyggende og behandlende på begge tilstander. Skjelettmuskulatur er et viktig sekretorisk organ som også skiller ut EV. Det har blitt utviklet en in vitro treningsmodell med elektrisk pulsstimulering (EPS), som induserer muskelkontraksjon på dyrkede skjelettmuskelceller. Målet med denne studien var å benytte treningsmodellen til å studere sekresjon og innhold i EV fra humane skjelettmuskelceller hos personer med ekstrem overvekt og T2DM for å lete etter potensielle, sirkulerende EV-biomarkører. Materiale og metoder: Humane skjelettmuskelceller (myoblaster) ble differensiert in vitro til modne myotuber. Halvparten av myotubene fikk kronisk lavfrekvent EPS-behandling i 24 timer, før alle celler ble dyrket videre i 24 timer med serumfritt medium og høstet. IL-6 ble målt i cellemediene for å se på effekt av EPS-behandling og total proteinkonsentrasjon ble analysert i cellelysatene som indirekte mål på antall celler i dyrkningsbrønnene ved høsting. EV ble isolert fra cellemediene med en kombinasjon av sentrifugerings- og ultrafiltrerings-teknikker slik at eksosomer og MV ble adskilt. Eksosomer og MV ble så karakterisert med hensyn på konsentrasjon, størrelse, overflatemarkører, proteininnhold og miRNAmengde før og etter elektrisk pulsstimulering. Nanoparticle tracking analysis (NTA) ble benyttet for å bestemme konsentrasjon og størrelse av eksosomer og MV. Flowcytometri ble brukt til å detektere overflatemarkører som CD9, CD81 og CD63, og proteomikk ble utført for å studere proteininnholdet. Tilstedeværelse av utvalgte muskelspesifikke miR (myomiR); miR1-3p, miR-133a og miR-206, og en ikke muskelspesifikk miR-223, ble analysert ved hjelp av kvantitativ revers transkriptase polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR), og eksosomer og MV ble sendt til transmisjon elektron mikroskopi (TEM) for å studere morfologien til vesiklene. Resultater: IL-6 konsentrasjon i cellemediet var signifikant økt etter elektrisk pulsstimulering av cellene som et tegn på at cellene hadde respondert på treningen. Det var ingen signifikant forskjell i konsentrasjon, størrelse, overflatemarkørene CD81 og CD63 eller miRNA-mengde verken i eksosomer eller MV etter EPS behandling. CD9 ble ikke påvist. Proteomikkanalyse viste at 75 proteiner i eksosomene og 57 proteiner i MV var til stede i signifikant forskjellig mengder etter EPS-behandling av cellene. Konklusjon: In vitro-dyrking av myotuber produserte EV i en mengde som lot seg kvantifisere og karakterisere. Elektrisk pulsstimulering på humane modne myotuber hadde ingen påvirkning på EVkonsentrasjon, størrelse, overflatemarkører eller miRNA-mengden i EV i forhold til kontrollceller. Proteomikkanalyse av EV-proteiner viste derimot signifikante forskjeller både i kvalitet og kvantitet. In vitromodellen kan benyttes videre til å identifisere nye EV-komponenter fra skjelettmuskelceller med potensiale som nye, sirkulerende biomarkører hos personer med ekstrem overvekt og T2DM.