Synthesis and LC-MS Analysis of Cinchona Derivatives

Abstract

Cinchona alkaloids with their main component Quinine, are isolated from the barks of several species of cinchona trees and have been used in medicine for over 400 years mainly as anti-malarial medication. These natural alkaloids contain 5 stereo-genic centers and share the same absolute configuration of 3 of these centers. ln 2001, Stork et al published the first stereoselective total synthesis of Quinine, but synthetic Quinine does not cover the global industrial and pharmaceutical demands for Quinine. This project investigated the purity of Quinine tablets that are produced in Norway by Norges Apotekforening (NAF), Kinin NAF® and used as an anti-malarial drug; as well as the purity of 6 raw derivatives of Quinine that are the most abundant Cinchona compounds: Quinine, Quinidine, Cinchonine, Cinchonidine, 10,11-Dihydro- quinine and 10,11-Dihydro-quinidine. Different stationary phases and different combinations of eluents, acidic water, methanol, and acetonitrile were tested. Reversed-phase High Performance Column Chromatography (HPLC) using an Octadecyl stationary phase (C18, ODS) in an acidic mobile phase, and Mass Spectrometry (MS) detection was used. A Difference in retention time behaviors was observed when changing the mobile phase solvents’ combinations and the pH. Results showed that derivatives of Quinidine with an absolute configuration 1S 3R 4S 8R 9S had shorter retention times than their corresponding Quinine derivates with the stereo descriptors of 1S 3R 4S 8S 9R. LC results revealed 8 molecules in a sample that had a mixture of the 6 analytes, indicating the presence of impurities. Different ratios of impurities in the form of dihydro derivatives of Quinine, Quinidine, Cinchonine and Cinchonidine were detected by MS. The analysis of Kinin NAF® revealed that it contains approximately 8% impurities in the form of dihydro and demethoxy derivatives of Quinine. This result was confirmed by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analysis. Synthesis of the two 10,11-dibromo-diastereomers of Quinine was performed to verify the relationship between the molecules’ retention times behavior and their stereochemistry. An LC method was developed to separate the synthesized 2 diastereomeric products using a C18 column with a difference in retention time of more than 2 minutes making it possible to separate them quantitatively so that their absolute configuration on the C10 atom can be determined utilizing NMR and if possible, X-Ray crystallography. Both LC-MS, LC-Time of Flight (LC-TOF) and NMR confirmed a pure form of the mixture of the 2 dibromo diastereomers.

Cinchona-alkaloider, med hovedkomponenten kinin, er isolert fra barken av flere arter av cinchona-trær. Forbindelsene har blitt brukt i medisin i over 400 år, hovedsakelig som medisin mot malaria. Disse naturlige forekommende alkaloidene inneholder 5 stereogeniske sentre og de deler samme absolutte konfigurasjon av tre av dem. I 2001 publiserte Stork et al den første stereoselektive totalsyntesen av kinin, men syntetisk kinin dekker ikke de globale industrielle og farmasøytiske etterspørselen av kinin. Dette prosjektet undersøkte renheten til kinintabletter som produseres i Norge av Norges Apotekforening (NAF), Kinin NAF® og brukes som et anti-malariamiddel. Videre ble renheten til 6 råderivater av kinin som er de mest utbredte cinchona-forbindelsene undersøkt: Kinin, kinidin, kinkonin, kinkonidin, 10,11-dihydrokinin og 10,11-dihydrokinidin. Analysene ble utført ved bruk av omvendt fase væskekromatografi. I de kromatografiske analysene ble ulike stasjonærfaser og forskjellige mobilfasesammensetninger av vann (surgjort), metanol og acetonitril testet ut. Den endelige analysemetoden var basert på High Performance Liquid Chromatography (HPLC) med bruk av en C18-stasjonærfase og en surgjort mobil fase (0,1 % FA, pH ⁓3). Et massespektrometer av typen "single quadrupole" ble brukt som detektor. Forskjeller i retensjonstidene i kromatogrammene ble observert som en kombinasjon av mobilfasesammensetning og pH. Resultatene viste at derivater av kinidin med en absolutt konfigurasjon 1S 3R 4S 8R 9S hadde mindre retensjonstider enn deres tilsvarende kininderivater med stereobeskrivelsene til 1S 3R 4S 8S 9R. Ulike innslag av urenheter ble funnet i prøvene, blant annet dihydroderivatene av kinkonin og kinkonidin. Disse urenhetene bestod da av de øvrige kininvariantene samt ytterligere to urenheter som ble identifisert dihydrokinkonidin og dihydrokinkonin. So totalt var 8 produkter detektert av MS i denne prøven som inneholdte 6 analyter. Analysen av Kinin NAF® tablettene avslørte at de inneholder om lag. 8% urenheter i form av dihydro- og demetoksyderivater av kinin. Dette resultatet ble bekreftet ved analyse med kjernemagnetisk resonans (NMR). Syntese av to 10,11-dibromdiastereomerer av kinin ble utført for å studere forholdet mellom molekylenes retensjonstider og deres stereokjemi. En HPLC-metode ble utviklet for å skille de to syntetiserte diastereomere produktene fra hverandre ved bruk av en C18-kolonne. En forskjell i retensjonstid over 2 minutter ble oppnådd mellom de to formene, noe som gjør det mulig å skille dem kvantitativt slik at deres absolutte konfigurasjon rundt C10-karbonatomet kan bestemmes ved hjelp av NMR - og om mulig - røntgenkrystallografi. Både LC-MS, LC-Time of Flight (LC-TOF) og NMR bekreftet en ren blandingen av de to dibromo-diastereomerene.