"HPV chromosomal integration as a biomarker for cancer progression" Validation and characterization of integration sites in HPV31, 33 and 45 positive cervical samples

Abstract

Background: Human papillomavirus (HPV) is associated with 4.5% of all human cancers worldwide including cervical cancer. Cytological and/or HPV primary screening is used to uncover cancer precursors. Still, better clinical specificity of screening procedures is warranted to decrease unnecessary follow-up and treatment. However, currently there is no ideal secondary diagnostic biomarker for predicting the risk of cancer progression. Viral integration is one of several reported potential biomarkers. Current HPV integration research often uses NGS approaches. NGS is a revolutionary technology but is prone to generating technical artefacts, which warrants validation of reported integrations using other methods, such as Sanger sequencing. Furthermore, most integration studies have focused on HPV16 and 18 because of their high prevalence in cervical cancer cases, and less in other HR-HPV types, such as 31, 33, and 45. The aim was to validate and characterize NGS reported HPV integrations in HPV31, 33, and 45 positive samples. Materials and methods: LBC samples were obtained from women with HPV31, 33, or 45 positive infections with a diagnostic category of LSIL/ASCUS, CIN2, CIN3, or cancer. The NGS reported HPV integrations were first investigated for known artefacts and filtered out. Subsequently, DNA templates and primer pairs were designed for the qualified HPV integrations containing a human and HPV-specific sequence. Subsequently, the sequences were Sanger sequenced and the data was processed. Finally, hot-spot and microhomology regions were identified. Results: 68% (21/31) of the NGS reported HPV integrations in 14 samples were confirmed with Sanger sequencing, accounting for 3.2% (1/31) HPV31 positive sample, 3.2% (1/31) HPV33 positive sample, and 61% (19/31) HPV45 positive samples. Of the confirmed proportion: 95% (20/21) had a CIN3 diagnostic category and 4.8% (1/21) cervical cancer. 24% (5/21) had integrations reported in hot-spot regions and 24% (5/21) were identified with microhomology regions at the integration breakpoints. Two of the confirmed HPV integrations mapped to the tumor suppressors p63 and Wilms protein, suggesting a role of these specific integrations in driving the cancer progression. Conclusions: Integrations in HPV45 positive CIN3 samples were significantly higher compared to HPV31 and 33 CIN3 samples. The confirmed HPV integrations were also found in hot-spots and with microhomology regions at the integration breakpoint, suggesting a nonrandom distribution of integration sites and a fusion between viral and human DNA through the microhomology-mediated DNA-repair pathway. Keywords: HPV31, HPV33, HPV45, cervical cancer, integrations, p53, pRb, microhomology, hot-spot regions, NGS, Sanger sequencing

Bakgrunn: Humant papillomavirus (HPV) er assosiert med 4,5% av alle humane krefttyper på verdensbasis, inkludert livmorhalskreft. Cytologi og HPV-testing, sammen eller hver for seg, blir anvendt for å avdekke forstadier til kreft gjennom screening. Det finnes imidlertid ingen ideell sekundær biomarkør for å predikere risiko for kreftutvikling. Mangel på klinisk spesifisitet i screeningprogram kan medføre unødvendig oppfølging og behandling. HPV integrasjon i det humane genom har blitt foreslått som en potensiell biomarkør. I dag bruker de fleste integrasjonsstudier NGS-metoder. NGS er en revolusjonerende teknologi, men som også produserer tekniske artefakter som må kontrolleres med andre metoder, slik som med Sanger sekvensering. I tillegg har de fleste integrasjonsstudier fokusert på HPV16 og 18 grunnet deres høye forekomst livmorhalskreft og færre studier gjort på andre kreftfremkallende (høyrisiko) HPV-typer slik som 31, 33 og 45. Mål: Validere NGS-rapporterte integrasjoner i HPV31, 33 og 45 positive prøver. Materialer og metoder: Celleprøver fra kvinner positive for HPV31-, 33- og 45 i følgende diagnostisk kategori: LSIL/ASCUS, CIN2, CIN3 eller kreft, ble inkludert i studien. De NGS-rapporterte HPV integrasjonene ble først undersøkt for kjente artefakter som ble filtrert bort. Templatesekvenser og tilsvarende primer-par bestående av human- og HPVspesifikk sekvens ble laget for de ufiltrerte HPV integrasjonene. Deretter ble integrasjonene Sanger-sekvensert og dataene prosessert. Hot-spot regioner og mikrohomologi regioner ble også identifisert. Resultater: 68% (21/31) av de NGS predikerte HPV integrasjonene fra 14 prøver ble bekreftet, tilsvarende 3,2% (1/31) HPV31- positive prøver, 3,2% (1/31) HPV33- positive prøver og 61% (19/31) HPV45- positive prøver. Blant de 21 integrasjonene var 95% (20/21) funnet i prøver med CIN3 og 4,8% (1/21) i prøver med livmorhalskreft. 24% (5/21) av de bekreftede HPV integrasjonene hadde integrasjoner rapportert i hot-spot regioner og 24% (5/21) ble identifisert med mikrohomologiregioner ved integrasjonsbruddpunktet. To av de bekreftede HPV integrasjonene mappet til tumorsuppressorgener som koder for hhv. p63 og Wilms protein. Konklusjon: Integrasjon i HPV45-positive CIN3-prøver var signifikant høyere sammenlignet med HPV31 og 33 positive CIN3-prøver. De bekreftede HPV-integrasjonene var også lokalisert i hot-spotregioner og med mikrohomologi områder ved integrasjonsbruddpunktet, som kan indikere en ikke-tilfeldig fordeling av integrasjoner i det humane genom og en fusjon mellom viralt og human DNA gjennom en mikrohomologi-mediert DNA reparasjonsmekanisme. Nøkkelord: HPV31, HPV33, HPV45, livmorhalskreft, integrasjoner, p53, pRb, mikrohomologi, hot-spot regioner, NGS, Sanger sekvensering