Migration of prostate cancer cells along neurite outgrowths: optimalization of experimental conditions and characterization of nerve-cancer co-cultures

Abstract

As approximately 5000 males are diagnosed with prostate cancer every year in Norway, prostate cancer persists as a medical issue today. It is shown that tumor innervation is important for development and progression of the tumor, as sympathetic impulses induces adrenergic activity in the tumor microenvironment. Increased adrenergic activity plays an important part of supplying the tumor with blood and nutrients by inducing angiogenesis and neurogenesis. The β2-adrenergic receptor (ADRB2) is the most prevalent adrenergic receptor in luminal cells of the prostate, contributing to progression and development of prostate cancer. ADRB2 has been shown to induce neuroendocrine differentiation (NED), trans differentiating prostate cancer cell to neuroendocrine-like (NE-like) cells, which is known to promote tumor progression and recurrence by autocrine stimulation and apoptosis resistance by attaining NE-like characteristics. Our research group have shown that patients using β-blockers, ADRB antagonists, have reduced prostate cancer related mortality. The overall aim of this study is to demonstrate the migration of the prostate cancer cells (PC-3-Luc2-GFP and C4-2B) towards neural PC-12 ADH cells pre-stimulated to induce neurite outgrowth and Schwann cells (RSC96), to characterize their migration rate. By stimulating the cell lines with the rho-associated kinase-inhibitor (ROCK-inhibitor) and the ADRB2 agonist isoproterenol (ISO), we wanted to determine the optimal concentration and time of each stimulation to induce the longest and highest number of neurite. By stimulating the cells with ROCK-inhibitor and ISO, we demonstrated that 50 μM ROCK-inhibitor induced the highest total neurite length per cell. This was mainly due to the increased number of neurites per cell although the average neurite length was also substantially increased in PC-3-Luc2-GFP cells. A migration assay was performed, demonstrating that the PC-3-Luc2-GFP cell line had the highest migration rate, in which the stimulation with ROCK-inhibitor did not decrease the migration in our study. We demonstrated that stimulation with ROCK-inhibitor, decreased the migration of PC-12 ADH cells and RSC96 cells. In contrast to C4-2B cells, stimulation with 50 μM ROCK were shown to decrease the proliferation in PC12 ADH and RSC96 cells as well as in PC-3-Luc2-GFP cells. ISO had no effect on cell growth in either cell lines. Taken together, the results of this study indicates that use of ROCK inhibitor can reduce the growth and progression of prostate by suppressing prostate cancer proliferation and cell migration toward nerves.

Ettersom cirka 5000 menn diagnostiseres med prostatakreft hvert år i Norge, vedvarer prostatakreft som et medisinsk problem i dag. Det er vist at tumor innervasjon er viktig for utvikling og progresjon av svulsten, da sympatiske impulser induserer adrenerg aktivitet i svulstens mikromiljø. Økt adrenerg aktivitet spiller en viktig rolle ved å forsyne svulsten med blod og næringsstoffer ved å indusere angiogenese og neurogenese. β2-adrenerg reseptor (ADRB2) er den mest utbredte adrenerge reseptoren i prostata, og bidrar til progresjon og utvikling av prostatakreft. ADRB2 har vist seg å indusere nevroendokrin differensiering (NED), transdifferensiering av prostatakreftceller til nevroendokrine-lignende (NE-lignende) celler, som er kjent for å fremme svulstprogresjon og tilbakefall ved autokrin stimulering og apoptose resistens ved å tilegne NE-lignende egenskaper. Forskningsgruppen vår har vist at bruk av spesifikke ADRB2-antagonister, β-blokkere, redusere dødelighet av prostatakreft. Det overordnede målet for denne studien er å demonstrere migrasjonen av prostatakreftceller (PC-3-Luc2-GFP og C4-2B) mot nevrale PC-12 ADH celler forhånds-stimulert for å indusere vekst av neuritter og Schwann-celler (RSC96), for å karakterisere deres migrasjons frekvensen. Ved å stimulere cellelinjene med rho-assosierte kinase inhibitoren (ROCK-inhibitor) og ADRB2-agonisten isoproterenol (ISO), ønsket vi å bestemme den optimale konsentrasjonen og tiden for hver av stimuleringene for å indusere det høyeste antallet- og de lengste utløperne. Ved å stimulere cellene med ROCK-inhibitor og ISO, demonstrerte vi at 50 μM ROCK-inhibitor induserte den høyeste totale neuritt lengden per celle. Dette skyldtes hovedsakelig det økte antallet neuritter per celle, selv om den gjennomsnittlige neurittlengden også ble betydelig økt i PC-3-Luc2-GFP-celler. Det ble utført en migrasjonsanalyse, som demonstrerte at PC-3-Luc2-GFP-cellelinjen hadde den høyeste migrerings frekvensen, der stimulering med ROCK-hemmer viste seg å ikke redusere migrasjonens frekvens i vårt studie. Vi demonstrerte at stimulering med ROCK-hemmer, reduserte migrasjonen av PC-12 ADH-celler og RSC96-celler. I motsetning til C4-2B-celler ble stimulering med 50 μM ROCK vist å redusere spredning i PC12 ADH- og RSC96-celler så vel som i PC-3-Luc2-GFP-celler. ISO hadde ingen effekt på cellevekst i noen av cellelinjene. Til sammen indikerer resultatene av denne studien at bruk av ROCK-hemmer kan redusere vekst og progresjon av prostata ved å undertrykke spredning av prostatakreft og cellevandring mot nerver.