Establishment of a new quantitative method for in situ detection of DNA breaks in human spermatozoa

Abstract

Background: There is increasing evidence that infertile men have higher levels of DNA fragmentation compared to fertile men. It was also shown that spermatozoa with highly fragmented DNA are less motile. Several tests are available to measure DNA fragmentation in spermatozoa, but they all focus on different aspects of it and most of them lack standardization. Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) is a standardized method that relies on fluorescence detection by flow cytometry and involve use of a licensed software. In 2020, a new method for measuring DNA fragmentation was published: STRIDE (SensiTive Recognition of Individual DNA Ends). The method is based on fluorescence microscopy and can detect single (sSTRIDE) or double (dSTRIDE) strand breaks in individual cells. In addition to detect DNA breaks in cell lines, STRIDE also showed a potential for measuring DNA fragmentation in spermatozoa. Aim: The main aim of this project was to establish and optimize sSTRIDE and dSTRIDE protocols for measuring DNA fragmentation in spermatozoa. Before that, we aimed to reproduce the STRIDE protocols in a somatic cell line as described in the original publication. At last, we wanted to compare results from STRIDE analyses with DNA fragmentation index values obtained earlier by SCSA in the same semen samples. Methods and materials: The MCF-7 cell line was used in attempts to reproduce STRIDE in somatic cells. Semen samples for STRIDE establishment and optimization were provided by Fertilitetssenteret in Oslo. In addition, some samples were obtained from an ongoing method-developing project in the research group. Samples from a biobank at OsloMet were used to compare DNA fragmentation analysed by dSTRIDE and DNA fragmentation index by SCSA. Heparin and DTT was used to decondense the chromatin structure in spermatozoa. Induction of DNA damage in the different cell types was performed using different amounts of hydrogen peroxide and UVB-irradiation. Immunofluorescence procedures to detect gamma-H2AX, a marker for DNA double stranded breaks, were performed to confirm the induction of DNA breaks. STRIDE signals were collected by 2-D and 3-D microscopy and analysed using the software ImageJ. Results: While we tried to make both dSTRIDE and sSTRIDE work in MCF-7 cells, only the dSTRIDE method was reproducible. The sSTRIDE method was then not further investigated. During the optimization of dSTRIDE in spermatozoa, coverslips were replaced with centrifuge tubes to minimize the un-specific background. A facultative chromatin decondensation step was implemented in the final dSTRIDE protocol and was shown to result in a larger number of positive signals. An increased amount of dSTRIDE foci was observed in the nucleus of spermatozoa after hydrogen peroxide exposure and UVB radiation compared to non-exposed cells. Motile spermatozoa prepared by swim-up harboured less dSTRIDE foci compared to spermatozoa from the whole ejaculate. Finally, no significant correlation was observed between the values obtained by dSTRIDE those generated by previous SCSA analyses in the same samples. Conclusion: dSTRIDE was established in MCF-7 cells and optimized for a robust protocol in spermatozoa. Unfortunately, the DNA-fragmentation results from dSTRIDE and SCSA did not correlate. Further work is necessary to validate and standardize the method so it can be used routinely.

Bakgrunn: Det er holdepunkter for at infertile menn har høyere andel spermier med DNA-skade sammenlignet med fertile menn. Det er også vist at spermier med høy DNA-skade er mindre motile. Ulike tester brukes for å måle andelen DNA-skade i spermier, men de måler ulike aspekter ved DNA-skade og fleste er ikke standardiserte. Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) er en standardisert metode som benytter flowcytometri for å detektere fluorescens-signaler, og har en lisensbelagt programvare. I 2020 ble det publisert en ny metode for DNA-fragmenteringsanalyse kalt STRIDE (SensiTive Recognition of Individual DNA Ends). Metoden baseres på fluorescensmikroskopi og kan gjenkjenne både enkelttråd-brudd (single; sSTRIDE) og dobbelttråd-brudd (double; dSTRIDE) i DNA på enkeltcellenivå. I tillegg til å detektere DNA-skade i cellelinjer viste metoden også potensiale til å måle DNA-fragmentering i spermier. Formål: Hovedformålet med oppgaven var å etablere og optimalisere sSTRIDE og dSTRIDE for å måle DNA fragmentering i spermier. Før dette forsøkte vi å reprodusere STRIDE-protokollene i en cellelinje basert på den originale artikkelen. Til sist ønsket vi å analysere prøver hvor det allerede forelå DNA-fragmenteringsresultater analysert ved hjelp av SCSA og sammenligne disse med resultatene fra STRIDE. Metoder og materialer: Cellelinjen MCF-7 ble brukt for å reprodusere STRIDE-metoden i somatiske celler. Sædprøvene for STRIDE etablering og optimalisering ble hentet fra Fertilitetssenteret i Oslo. I tillegg ble det brukt prøver samlet i forbindelse med metodeutvikling i forskningsgruppen. Prøver fra en biobank ved OsloMet ble brukt for kunne sammenligne mengde DNA-skade analysert ved hjelp av dSTRIDE-metoden med DNA-fragmenteringsindeks ved SCSA. Heparin og DTT ble benyttet for å åpne kromatinstrukturen. For å indusere DNA-skade ble celler eksponert for ulike mengder hydrogenperoksid og UVB-stråling. Immunofluorescens rettet mot gamma-H2AX, en markør for dobletråd-brudd i DNA, ble utført for å bekrefte DNA skade. Resultater ble visualisert ved bruk av 2-D og 3-D fluorescens mikroskopi og analysert ved bruk av programvaren ImageJ. Resultater: Både sSTRIDE og dSTRIDE ble forsøkt reprodusert i MCF-7 celler, men det var bare dSTRIDE som lot seg reprodusere. Etter gjentatte forsøk ble det bestemt at sSTRIDE skulle tas ut av prosjektet. Under etableringsprosessen av dSTRIDE-metoden på spermier, ble det funnet ut at deler av protokollen måtte gjøres i sentrifugerør for å minimere uspesifikk bakgrunn ved dSTRIDE. Prosedyre for å åpne kromatinstrukturen i spermier ble inkludert i dSTRIDE protokollen og resulterte i flere dSTRIDE-signaler sammenlignet med resultater fra spermier med kondensert kromatin. Det ble observert økende dSTRIDE-signal i kjernen i spermiene etter eksponering for hydrogenperoksid og UVB-stråling sammenlignet med ikke-eksponerte celler. I motile spermier isolert ved «swim-up» var det mindre dSTRIDE-signal sammenlignet med spermier fra hele sædprøven. Det var ingen sammenheng mellom mengde DNA-skade detektert ved hjelp av dSTRIDE og DNA fragmenteringsindeks ved hjelp av SCSA. Konklusjon: dSTRIDE ble etablert i MCF-7 celler og i tillegg optimalisert for en robust protokoll i spermier. Dessverre, var det ingen korrelasjon mellom DNA-fragmenteringsresultatene fra dSTRIDE og SCSA. Videre arbeid er nødvendig for å validere og standardisere metoden slik at den kan bli brukt rutinemessig.