Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis for cortisol as a stress biomarker to monitor fish welfare

Abstract

Background: Norway is the world’s biggest salmon producer and the salmon industry has grown to become Norway’s second largest export industry in value, after oil and gas. Despite the impressive growth, the industry is still facing issues around animal welfare and fish health. Stress can be a triggering cause of compromised fish health and disease outbreaks. Cortisol is the most important glucocorticoid and plays a key role in the stress response of an animal. However, limited analytical tools are available for assessing cortisol and it is challenging to sample fish non-invasively. FishLab AS wants to investigate whether it is possible to quantify cortisol in fish feces with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and use this method as a tool to monitor fish welfare. Aim: The aim of the current project was to develop and validate a high-quality LC-MS/MS method to assess stress in fish by measuring cortisol in fish feces. Methods: Sample preparation was improved by optimization of cortisol extraction, derivatization, separation and detection. Enzymatic, acidic and basic hydrolysis were evaluated for maximizing cortisol deconjugation. Liquid-liquid extraction (LLE) and saltingout assisted liquid-liquid extraction (SALLE) were evaluated as cortisol extraction methods using different organic solvents with the addition of sodium chloride (NaCl). Signal enhancement was explored through derivatization with 4-aminobenzoic hydrazide (4-ABH). Liquid chromatography (LC) separation of derivatized cortisol (cortisol-4-ABH) was investigated under gradient condition using water solution with either 0.2% ammonia hydroxide or 0.2% formic acid with 0.2% methanol water solution. Finally, cortisol-4-ABH was detected using tandem mass spectrometry (MS/MS) with optimum multiple reaction monitoring (MRM) transitions for cortisol mono-hydrazone products under electrospray ionization in positive mode (ESI+). The use of deuterium labeled internal standards determined cortisol concentrations. The method was then validated for repeatability, intermediate precision, recovery, linearity, limit range, limit of detection (LOD) and quantification (LOQ). Results: Cortisol deconjugation was most efficient when using Helix Pomatia with 2 M ammonium acetate buffer of pH 6 at 1 h incubation. LLE with tert-butyl methyl ether (MTBE) and 100 \𝜇��\𝑙�� NaCl was the most preferable method for cortisol extraction with less ion suppression and acceptable percentage of relative extraction recovery (REC%). Cortisol-4-ABH provided much higher ESI+ response than underivatized cortisol. A derivatization step was therefore included in the method. A 0.2% ammonium hydroxide III solution provided highest analytical sensitivity for cortisol mono-hydrazone detection. The repeatability coefficient of variation in percent (CV%) were 16.7 and 11% for individual and replicate samples. The method intermediate precision CV% was 10.5% and relative spike recovery in percent (R´%) were 114, 126 and 127%. A linear regression model obtained from calibration curve exhibited a linear range within 0.09 – 100 ng/mL with a regression coefficient (R2 ) of 0.997 – 0.999. The LOD and LOQ for cortisol were 0.04 and 0.09 ng/mL. Conclusion: Fish feces samples gathered from off- and onshore industrial fish farms showed cortisol levels highly above LOD and LOQ. The majority of samples contained 5 – 12 ng/g however, a subset of fish displayed clearly elevated levels about 3 – 4 times higher than the average observed. These differences are much higher than the intermediate precision of the method, and therefore suggest that the developed method could be a useful tool to assess the stress level in fish.

Bakgrunn: Norge er verdens største lakseprodusent og laksenæringen har vokst til å bli Norges nest største eksportnæring i verdi etter olje og gass. Til tross for den imponerende veksten, står industrien fortsatt overfor problemer rundt dyrevelferd og fiskehelse. Stress kan være en utløsende årsak til nedsatt fiskehelse og sykdomsutbrudd. Kortisol er det viktigste glukokortikoidet og spiller en viktig rolle i stressresponsen hos dyr. Derimot er begrensede analytiske verktøy tilgjengelig for å vurdere kortisol samtidig er det utfordrende med å samle inn fiske prøve på en ikke-invasiv måte. FishLab AS ønsker å undersøke om det er mulig å kvantifisere kortisol i fiskeavføring med væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) og bruke denne metoden som et verktøy for å overvåke fiskevelferd. Formål: Hovedformålet med det nåværende prosjektet var å utvikle og validere en høykvalitets LC-MS/MS metode for å vurdere stress hos fisk ved å måle kortisol i fiskeavføring. Metoder: Prøveforberedelse ble forbedret ved optimalisering av kortisol ekstraksjon, derivatisering, separasjon og deteksjon. Enzymatisk, sur og basisk hydrolyse ble evaluert for å maksimere kortisol dekonjugering. Væske-væske-ekstraksjon (LLE) og salte-ut assistert væske-væske-ekstraksjon (SALLE) ble evaluert som kortisol ekstraksjons metoder ved bruk av forskjellige organiske løsningsmidler med tilsetning av natriumklorid (NaCl). Signalforbedring ble studert gjennom derivatisering med 4-aminobenzosyre hydrazid (4-ABH). Væskekromatografi (LC) separasjon av derivatisert kortisol (kortisol-4-ABH) ble undersøkt under et gradientforhold ved bruk av vannløsning med enten 0,2 % ammoniakkhydroksid eller 0,2 % maursyre med 0,2 % metanol vannløsning. Til slutt ble kortisol-4-ABH detektert ved bruk av tandem massespektrometri (MS/MS) med optimal multippelreaksjonsovervåking (MRM) for kortisol mono-hydrazon produkter under elektrosprayionisering i positiv modus (ESI+). Bruken av deuteriummerkede intern standarder bestemte kortisol konsentrasjoner. Metoden ble deretter validert for repeterbarhet, intermediær presisjon, gjenfinning, linearitet, grenseområde, grense for deteksjon (LOD) og kvantifisering (LOQ). Resultater: Kortisol dekonjugering var mest effektiv med bruk av Helix Pomatia og 2 M ammonium acetat buffer ved pH 6 og 1 times inkubering. LLE med tert-butylmetyleter (MTBE) og 100 \𝜇�\𝑙� NaCl var den mest foretrukne metoden for kortisol ekstraksjon med minst ione suppresjon og akseptabel relativ ekstraksjon gjenfinning i prosent (REC%). Kortisol-4-ABH ga mye høyere ESI+ respons enn ikke-derivert kortisol. Et derivatiserings V trinn ble derfor inkludert i den endelige metoden. En 0,2 % ammoniumhydroksid løsning ga høyere analytisk sensitivitet for kortisol mono-hydrazon deteksjon. Repeterbarhet variasjonskoeffisient i prosent (CV%) var 16,7 og 11 % for individuelle og replikate prøver. Metodens intermediær presisjon i CV% var 10,5 % og relativ spiket gjenfinning i prosent (R´%) på 114, 126 og 127 %. En linear regresjons modell hentet fra kalibreringskurven viste et lineært område innenfor 0,09 – 100 ng/mL med regresjonskoeffisient (R2 ) verdi 0,997 – 0,999. Grensen for deteksjon (LOD) og kvantifisering (LOQ) var 0,04 og 0,09 ng/mL. Konklusjon: Fiskeavføringsprøver samlet fra off- og onshore industrielle oppdrettsanlegg viste kortisol nivåer høyt over LOD og LOQ. Flertallet av prøvene inneholdt 5 – 12 ng/g derimot viste en undergruppe av fisk klart forhøyet nivå som var omkring 3 – 4 ganger høyere enn gjennomsnittet som ble observert. Disse forskjellene er mye høyere enn den intermediære presisjonen til metoden og antyder derfor at den utviklede metoden kan være et nyttig verktøy for å vurdere stressnivået i fisk.