Change in content of extracellular vesicles from human skeletal muscle cells after electrical pulse stimulation with focus on microRNA.

Abstract

Background and Aim

Extracellular vesicles (EVs) are nanoparticles with a double membrane postulated to be released by cells of all types and can be detected in all body fluids. They are classified in three groups exosomes, microvesicles and apoptotic bodies and encompasses lipids, proteins, and nucleic acids (RNA and DNA). In a previous master thesis, studies were done on electrically stimulated skeletal muscle cell derived EVs. In that study, it was illustrated that, skeletal muscles release EVs. These EVs were found to contain proteins on which electrical pulse stimulation (EPS) had significant effects. In addition, a pilot experiment found that the EVs encompassed mircroRNAs, whose functions were not fully understood. EVs have been suggested to be mediators of cell-to-cell communication and regular physical activity has been proven to prevent T2DM and improve blood sugar levels. It was of interest to find out whether electrical pulse stimulation could have any effects on microRNA encompassed in EVs derived from extremely obese patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM), since it had had significant effects on proteins.

Methods

Primary human skeletal muscle cells isolated from abdominal muscle biopsies were cultured and allowed to differentiate into myotubes. Half of the cells were stimulated using a low-frequency EPS for 24 hours. The media were collected and used for interleukin-6 (IL-6) concentration measurement. After incubation of the cells in serum free media for 24 hours, the media was harvested, and used for EVs (exosomes and microvesicles) isolation, and the EVs were characterized using transmission electron microscopy (TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA and western blotting. Exosome content of microRNA was accessed by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Affymetrix microarray technology.

Results

The interleukin-6 concentrations in the cell media tended to be increased by 37% after EPS, although not significant (p=0.11). TEM pictures showed a spherical morphology and a cup shaped structure of EVs, typical characteristics. The mean size of unstimulated exosomes was 139 nm and 141 nm after EPS. Microvesicles were significantly larger, unstimulated 158 nm and stimulated 164 nm. In the identification of EVs surface biomarkers, the presence of CD63 and Hsc70/Hsp70 was shown, whereas CD9 was not present. RT-qPCR illustrated that skeletal muscle cell derived EVs were enriched with microRNA, the three myo-miRs, miR-1-3p, miR-133a and miR-206 were detected.

Affymetrix microarray analysis performed on three donors were loaded in Ingenuity Pathway analysis software (IPA). A total of 271 transcripts were detected and out of the total, 219 were miR. Analysis of Affymetrix microarray data in IPA showed significant effects of EPS on 12 miRs. This was based on filtering the miRs by p<0.05, >1.5-fold change and “signal value” above 5. Pathway analysis showed their involvement in diseases and biological functions, and these included neurological diseases, psychological disorders, post-translational modification, connective tissue development and function, cardiovascular system development and function. A prediction of top upstream regulators and their interaction network suggested AGO2 (argonaute RISC catalytic component 2), MET (MET Proto-Oncogene, Receptor Tyrosine Kinase), TGS1 (Trimethylguanosine synthase 1), XPO1 (Exportin 1) and TP53 (Tumor protein p53) among others. Database search for targets of the miRs identified several possible targets of the regulated miRs.

Conclusion

Electrical pulse stimulation had a noticeable effect on miR content in exosomes, with a significant difference in 12 specific miRs between unstimulated and stimulated (EPS) myotubes. Characterization of EVs illustrated that EPS had no effect on EVs concentrations and sizes. The changes caused in EVs´ miR content by EPS might play an important role in numerous biological functions of mediating beneficial effects of exercise.

Bakgrunn og formål

Extracellulære vesikler (EV) er nanopartikler med en dobbel membran som kan påvises i alle kroppsvæsker. De er klassifisert i tre grupper, eksosomer, mikrovesikler og apoptotiske legemer, og inneholder lipider, proteiner og nukleinsyrer (RNA og DNA). I en tidligere masteroppgave ble det gjort studier på EVer avledet fra elektrisk stimulerte skjelettmuskelceller. I studien ble det vist at skjelettmuskelceller frigjør EV. Disse EVene ble funnet å inneholde proteiner som elektrisk pulsstimulering (EPS) hadde signifikante effekter på. I tillegg, viste en pilotstudie at EVene inneholdt mikroRNA, men hvor deres funksjoner ikke ble fullstendig undersøkt. EV har blitt foreslått å være formidlere av intercellulær kommunikasjon, og regelmessig fysisk aktivitet har vist å kunne forhindre T2DM og forbedre blodsukkernivå. Det var av interesse å finne ut om elektrisk pulsstimulering kunne ha noen innvirkning på mikroRNA i EV isolert fra sykelig overvektige pasienter med T2DM siden det tidligere hadde hatt signifikante effekter på proteiner.

Metoder

Primære humane skjelettmuskelceller isolert fra magemuskelbiopsier ble dyrket og differensierte til myotuber. Etter differensiering ble halvparten av cellene stimulerte (EPS) ved en lav frekvens i 24 timer. Medier ble samlet og brukt til interleukin-6 (IL-6) konsentrasjonsmåling. Etter inkubering av cellene i serumfritt medium i 24 timer, ble mediene høstet for EV-isolering (eksosomer og mikrovesikler), og EV-ene ble karakterisert ved hjelp av transmisjon elektron mikroskopi (TEM), nanopartikkel tracking analyse (NTA), western blott, kvantitative revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) og Affymetrix mikroarray. MikroRNA-innholdet i eksosomer ble analyserte ved kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) of Affymetrix microarray teknologi.

Resultater

Interleukin-6-konsentrasjon, i cellemediene viste tendens til økning med 37 % etter EPS, men det var ikke signifikant forskjeller (p=0,11). TEM-bilder viste en sfærisk morfologi og en koppformet struktur som er typiske EV-karakteristikker. Gjennomsnittlig størrelse på ustimulerte eksosomer var 139 nm og 141 nm etter EPS. Mikrovesikler var betydelig større, ustimulerte 158 nm og stimulerte 164 nm. Ved identifisering av overflatebiomarkører i EVer ble tilstedeværelsen av CD63 og Hsc70/Hsp70 vist, mens CD9 ikke var til stede. RT-qPCR illustrerte at EVer avledet fra skjellettmuskelceller inneholdt mikroRNA. De tre myo-miRene, miR-1-3p, miR-133a og miR-206 ble detektert.

I Affymetrix mikroarray analyse utført på EVer fra tre givere ble lastet inn i Ingenuity Pathway analysis (IPA). Totalt 271 transkripter var detektert, og av totalen var det 219 som var miRer. Analyse av Affymetrix mikroarray-data i IPA viste signifikante effekter av EPS på 12 miRer. Dette var basert på filtrering av miRer ved p<0,05, >1,5 fold-change og «signalverdi» over 5. Pathway-analyse foreslo deres deltagelse i sykdommer og biologiske funksjoner inkluderte nevrologiske sykdommer, psykologiske lidelser, posttranslasjonell modifisering, bindevevsutvikling og-funksjon, kardiovaskulær systemutvikling og funksjon. IPA prediksjon av topp oppstrøms regulatorer og deres interaksjonsnettverk pekte på blant annet AGO2 (argonaute RISC catalytic component 2), MET (MET Proto-Oncogene, Receptor Tyrosine Kinase), TGS1 (Trimethylguanosine synthase 1), XPO1 (Exportin 1) and TP53 (Tumor protein p53). Databasesøk identifiserte flere mulige mål for de regulerte miRene.

Konklusjon

Elektrisk pulsstimulering hadde en signifikant effekt på miRer-innholdet i eksosomer, hvor det var en signifikant forskjell i 12 spesifikke miRer mellom ustimulerte og stimulerte (EPS) myotuber. Karakterisering av EVene viste at EPS ikke hadde noe effekt på EVs konsentrasjoner og størrelser. Endringene i EVs miR innhold forårsaket av EPS kan spille en viktig rolle i en rekke biologiske funksjoner som muligens gir gunstige effekter av trening.