Combination treatments with regorafenib in preclinical models of colorectal cancer

Abstract

Introduction. Colorectal cancer (CRC) is the second most common cancer type in Norway in both genders. Active chemotherapy is used in first-line treatment regimens for patients with metastatic CRC (mCRC), which includes irinotecan and oxaliplatin. Regorafenib is a new promising drug that has demonstrated efficient anticancer activity against mCRC and is currently approved for third line treatment of mCRC, but the clinical use is limited since the effect of regorafenib is short lasted and patients develop resistance over time. Currently there are no other treatment options for mCRC patients with disease recurrence after treatment with all available standard therapies. Drug resistance that affect the tumors sensitivity is still the major cause of treatment failure. Combination treatment with various drugs might improve the response and could also lead to regorafenib being implemented in mCRC treatment at an earlier stage. Methods. We examined the drug sensitivity when co-administering regorafenib in combination with irinotecan or oxaliplatin in HCT-116 and SW-620 cell lines, in addition to PDX-models. Combination treatment experiments were performed to identify potential synergistic effects due to interactions between these drugs. Western Blot Immunoassay was performed to investigate the expression of selected proteins and phospho-proteins in different signaling pathways that are influenced by regorafenib and irinotecan, in an attempt to elucidate a possible mechanistic reason for synergistic effects at the protein level. In addition to this, differences in MUC-2 in a PDX-model and topoisomerase-1 expression in cell lines were investigated using RT-qPCR and immunofluorescence respectively. Results. Regorafenib, irinotecan and oxaliplatin exhibited anti-proliferative effects as single agents in HCT-116 and SW-620 cell lines. Regorafenib and irinotecan target signaling pathways such as MAPK, PI3K-Akt and JAK/STAT, in addition to inducing apoptosis by interfering with intracellular DNA damage signaling pathways. Combined treatment with regorafenib and irinotecan induced a synergistic anti-proliferative effect in HCT-116 and SW-620 cell lines, while oxaliplatin tended to show additive or antagonistic effects in combination with regorafenib. The synergistic drug effects to regorafenib and irinotecan in the cell lines tended to be reflected in the PMCA-2 model, which also suggests a beneficial outcome with this treatment combination. No mechanistic explanation for the synergistic interactions between regorafenib and irinotecan was observed by performing protein analysis with Western Blotting. Both HCT-116 and SW-620 cells exhibited nuclear expression of topoisomerase-1, but exhibited a cell type dependent reduction of the enzyme after drug treatment. Conclusions. While the favorable synergistic actions observed with regorafenib in combination with irinotecan may suggest this as a promising treatment option, which could improve survival among mCRC patients, the combination with oxaliplatin would not. Further investigation is needed to draw a solid conclusion, and to improve our knowledge about the mechanistic explanation behind the synergistic effects.

Introduksjon. Kolorektal kreft (CRC) er en av de vanligste kreft formene i Norge for begge kjønn. Aktiv kjemoterapi blir brukt i førstelinjebehandlings regimer for pasienter med metastatisk CRC (mCRC) som inkluderer irinotecan og oxaliplatin. Regorafenib er et nytt lovende medikament som har demonstrert effektiv anti-cancer aktivitet imot mCRC og er i øyeblikket godkjent som tredjelinjebehandling mot mCRC, men den kliniske verdien er begrenset siden effekten av regorafenib er kortvarig og fordi at pasientene utvikler resistens over tid. For øyeblikket er det ingen alternative behandlingsmuligheter for mCRC pasienter med tilbakefall etter behandling med alle tilgjengelige standard terapier. Medikament resistens som reduserer tumor sensitivitet er fremdeles den største årsak til uvirksom behandling. Kombinasjonsbehandling med ulike medikamenter vil muligens kunne forbedre responsen og kan også lede til at regorafenib blir implementert tidligere i behandling imot mCRC. Metoder. Vi studerte medikament sensitivitet av regorafenib i kombinasjon med irinotecan eller oxaliplatin i HCT-116 og SW-620 cellelinjer, i tillegg til PDX-modeller. Kombinasjon behandlings eksperimenter ble utført for å identifisere potensielle synergistiske effekter forårsaket av interaksjon mellom disse medikamenter. Western Blot Immunoassay ble utført for å studere uttrykk av utvalgte proteiner og fosforylerte proteiner i forskjellige signalveier som er påvirket av regorafenib og irinotecan, i et forsøk på å belyse potensielle mekanistiske årsaker til synergistiske effekter på protein nivå. I tillegg til dette ble det studert forskjeller i MUC-2 i PDX-modell og topoisomerase-1 uttrykk i celle linjer ved å bruke RT-qPCR og immunofluorescence. Resultater. Regorafenib, irinotecan og oxaliplatin utviste anti-prolifererende effekter enkeltvis i cellelinjene, HCT-116 og SW-620. Regorafenib og irinotecan påvirker MAPK, PI3K-Akt og JAK/STAT signalveiene, i tillegg til å indusere apoptose ved å interferere med intracellulære DNA skade signalveier. Kombinasjon behandling med regorafenib og irinotecan induserte synergistisk anti-prolifererende effekter i HCT-116 og SW-620 cellelinjene, mens oxaliplatin hadde tendens til å utvise additive eller antagonistiske effekter i kombinasjon med regorafenib. De synergistiske effekter med regorafenib og irinotecan i cellelinjene så ut til å bli gjenspeilet i PMCA-2 modellen, som igjen impliserer fordelene ved bruk av denne behandlingen. Ingen mekanistisk forklaring på den synergistiske interaksjonen mellom regorafenib og irinotecan ble observert ved å utføre proteinanalyse med Western Blotting. Både HCT-116 og SW-620 cellene utviste nukleært uttrykk av topoisomerase-1, men utviste celle type avhengig reduksjon av enzymet etter medikament behandling. Konklusjon. Mens de ønskede synergistiske effekter observert med regorafenib kombinert med irinotecan kan implisere dette som en lovende alternativ til behandling, som kan forbedre overlevelse blant mCRC pasienter, så tyder det på at kombinasjon med oxaliplatin ikke vil dette. Videre undersøkelser er nødvendig for å komme fram til en solid konklusjon, og for å få bedre forståelse av de mekanistiske forklaringene som står bak synergistiske effekter.