Etablering av metode for helgenomsekvensering og typing av enterovirus spesies A-D på Ion S5 Prime og Nanopore MinION Mk1B

Abstract

Bakgrunn: Enterovirus serotyper under enterovirus spesies A-D kan gi både mild og alvorlig sykdom hos mennesker. Nyfødte er spesielt utsatt for alvorlig sykdom ved smitte av enkelte enterovirus serotyper, og typing av enterovirus er derfor et viktig verktøy i overvåkning av enterovirus-utbrudd ved nyfødtintensiv-avdelinger. Mulighet for helgenomsekvensering av enterovirus er også av stor betydning for forskningsprosjekter som for tiden utføres ved Sykehuset Østfold. Mål: Å etablere en metode for helgenomsekvensering og typing av enterovirus spesies A-D fra ulike prøvematerialer på sekvenseringsplattformen Ion S5 Prime, og å etablere en metode for typing av enterovirus spesies A-D på sekvenseringsplattformen Nanopore MinION Mk1B. Metoder og materialer: Enterovirus-RNA ble revers transkribert og amplifisert med to parallelle ett-trinns RT-PCR reaksjoner, som genererte to lange overlappende genomfragmenter. Disse genomfragmentene ble benyttet for sekvensering og typing av enterovirus på Ion S5 Prime, mens genomfragmentet som dekket kodende nukleotidsekvens for overflateproteinene VP1-VP4 ble benyttet for sekvensering og typing av enterovirus på Nanopore MinION Mk1B. Seks oppdyrkede enterovirus-stammer ble benyttet til etablering av metode, før metoden ble verifisert på ti anonymiserte pasientprøver bestående av fæces, spinalvæske og nasofarynkssekret med tidligere påvist enterovirus. Resultat: Sekvensering på Ion S5 Prime resulterte i dekning på ca. 94 % av enterovirusets genom for fem av seks enterovirus-stammer, alle med en gjennomsnittlig dybde på > 2 034. Sekvensering av første halvdel av genomet på Nanopore MinION Mk1B, resulterte i en gjennomsnittlig dybde på 26-1 108. For enterovirus fra ti pasientprøver ble det oppnådd en gjennomsnittlig dybde per base på > 1 458 ved sekvensering på Ion S5 Prime, og 94 % dekning ble oppnådd for syv av elleve påviste enterovirus. For resterende enterovirus ble det oppnådd en dekning på 59-78 %. Sekvensering på Nanopore MinION Mk1B resulterte i en gjennomsnittlig dybde per base på 2-1 108. Sekvenserte enterovirus fra pasientprøver ble ved begge sekvenseringsplattformer typet med > 94,5 % «Pairwise Identity» ved bruk av nukleotidsekvens for overflateproteinet VP1 som benyttes for typing av enterovirus. Ett enterovirus fra én pasientprøve feilet ved sekvensering på Nanopore MinION Mk1B. Konklusjon: I løpet av prosjektet har det blitt etablert en metode som gir mulighet for sekvensering av opp til 94 % av genomet for enterovirus spesies A-D, med en høy gjennomsnittlig dybde per base, til bruk på Ion S5 Prime. Metoden gir også mulighet for typing av enterovirus spesies A-D. En metode for typing av enterovirus spesies A-D har også blitt etablert ved sekvensering av kodende nukleotidsekvens for overflateproteinene VP1-VP4 på Nanopore MinION Mk1B. For begge sekvenseringsplattformer trenger metoden et større testgrunnlag før implementering for å undersøke metodens sensitivitet for ytterligere enterovirus serotyper i ulike prøvematerialer.