Endocytosis of Extracellular Vesicles

Abstract

Extracellular Vesicles (EVs) are nanosized, membranous vesicles released by most cells into the extracellular environment. They are thought to reflect their cell of origin and carry proteins, lipids, nucleic acids, and other molecules in their aqueous core, as well as markers and several other membrane components. They are implicated in an array of physiological and pathological conditions, and the interest of EVs in research is expanding. Even if there are many challenges to overcome, the promising potential of EVs in diagnostics and therapy is exciting. The possible use of EVs as biomarkers and in drug therapy is highlighted. There is much focus on studying the biogenesis of EVs, however, evidencing the uptake of EVs in recipient and the endocytic mechanisms utilized to internalize EVs will be the focus of this thesis. EVs derived from an SW480 cancer cell line were produced and isolated from supernatants, characterized, fluorescently labelled with PKH67, and incubated with human primary monocytes and lymphocytes, elutriation isolated from whole blood at the lab. Several experiments establishing a general protocol for investigating the uptake of EVs in monocytes and lymphocytes were carried out and the uptake measured and visualized by flow cytometry, fluorescence microscopy, confocal microscopy, and live imaging. Several frequently used inhibitors of endocytosis were introduced to the experimental system to investigate which endocytic pathways were involved. Titration of suitable dosage ranges that were effective in inhibiting uptake, as well as not being toxic, was performed. The actin polymerization agent Cytochalasin D and the PI3K-inhibitor Wortmannin showed great promise and will be investigated further in the future. The dynamin2 inhibitor Dyngo and Na+/H+ pump inhibitor EIPA need further titrations to find the therapeutic window. LY294002 was determined to be unsuitable for the experimental model set-up altogether. The uptake of PKH67 labelled SW480 derived EVs in human primary monocytes, but not in lymphocytes, was found to be time –and dose dependent, shown by flow cytometry, fluorescence microscopy, and live imaging. Proof of internalization of EVs was obtained with confocal microscopy and live imaging. Dose titration and viability testing of the inhibitors chosen is still a work in progress, but inhibition of endocytic pathways indicated that EVs were internalized in monocytes by phagocytosis in an actin- and PI3K-dependent manner.

Ekstracellulære vesikler (EV) er små vesikler med dobbeltmembran kun få nanometer store i diameter. De fleste celler i kroppen skiller ut vesikler og man tenker seg at innholdet og membrankomponentene sier noe om cellen den ble laget i. EV kan inneholde ulike proteiner, lipider, nukleinsyrer og mange andre molekyler i den vandige kjernen, mens membranen kan inneholde ulike membrankomponenter og markører. EV har vist seg å være delaktige i en rekke fysiologiske og patologiske tilstander, og interessen for EV i forskning både nasjonalt og internasjonalt øker. På tross av utfordringer relatert til standardisering av metoder og karakterisering av ulike vesikkelpopulasjoner, har EV et stort potensiale i diagnostikk og terapi. Man håper at EV kan brukes som biomarkører for ulike sykdommer. Mange forskningsgrupper studerer biogenese, isolering og karakterisering av EV, men i denne oppgaven fokuseres det på opptak av EV i mottagende celler og belysning av de ulike endocytosemekanismene ved bruk av inhibering. EV ble isolert fra supernatanten fra en SW480 kreftcellelinje, deretter karakterisert, merket med fluorescerende membranmerking PKH67, og inkubert med humane, primære monocytter og lymfocytter. En rekke pilotforsøk ble utført for å etablere en generell protokoll for studier av opptak av EV i monocytter og lymfocytter. Metodene som ble brukt var flowcytometri, fluorescensmikroskopi, konfokalmikroskopi og live imaging. Flere velkjente inhibitorer av endocytosemekanismer ble introdusert til det eksperimentelle systemet for å undersøke hvilke opptaksmekanismer som ble brukt. Påfølgende titreringsforsøk ble utført for å finne et passende doseringsintervall som hadde en hemmende effekt på opptak av EV i mottagercellene, men som samtidig ikke var toksiske for generell celleoverlevelse. Resultatene fra denne masterstudien viser at EV produsert fra SW480 celler tas opp i humane, primære monocytter, men ikke i lymfocytter. Opptaket er dose- og tidsavhengig. Internalisering av EV i monocytter ble påvist ved hjelp av konfokalmikroskopi og live imaging. Inhibering av ulike endocytosemekanismer, ved hjelp av kjemikalier, indikerer at EV blir tatt opp via fagocytose, men arbeidet må videreføres før endelige konklusjoner kan gis.