Characterization of differentially expressed miRNAs and their predicted target transcripts associated with smoltification and seawater adaptation in Atlantic salmon

Abstract

Smoltification, or parr-smolt transformation, is a complex pre-adaptive process of behavioral, developmental, biochemical, and physiological changes that transforms an Atlantic salmon parr living in freshwater (FW) into a seawater (SW)-ready smolt. Successful smoltification is crucial for long-term adaptation to SW, survival, and growth in the sea. In contrast, suboptimal smoltification contributes to higher mortality in the SW phase and increases the risk of poor development, growth, and health. Suboptimal smoltification remains a challenge for Atlantic salmon production in Norway, leading to substantial economic losses. MicroRNAs (miRNAs) are important post-transcriptional regulators of gene expression that play critical roles in various biological processes. The aim of this project was to investigate whether any Atlantic salmon miRNAs are involved in the regulation of smoltification and seawater adaptation (SWA), and to reveal biological processes that are likely controlled by these particular miRNAs. High-throughput sequencing of small RNAs in three key organs (head kidney, liver, and gill) of Atlantic salmon was used to characterize changes in miRNA expression associated with smoltification and SW adaptation. This revealed 62, 54, and 18 miRNAs that were differentially expressed (DE) in liver, head kidney, and gill, respectively. Further investigations indicated that these likely are biologically important guide miRNAs (gDE-miRNAs). Microarray analyses of same materials revealed 5708, 2709, and 2382 mRNAs as differentially expressed in liver, head kidney and gill, respectively. Among these, 2804, 1827, and 747 DE-mRNAs were predicted to be miRNA targets of the gDE-miRNAs in liver, head kidney, and gills, respectively. Gene enrichment analysis of negatively correlated miRNA-mRNA interactions in head kidney showed that they were enriched in important biological processes such as hormone synthesis, stress response, immune response, and ion transport. Furthermore, gene enrichment of DE-miRNA targets in the liver and gills also revealed several enriched biological processes that likely involve post-transcriptional control by the gDE-miRNAs. These include carbohydrate and lipid biosynthesis, amino acid and steroid metabolism, protein transport, response to external stimuli, the immune system, and extracellular organization. Critical genes important in smoltification, such as Cytochrome P4501A (cyp1a1), Na+, K+-ATPase subunits (nkaα1a, nkaα1b and nkaβ), ion transporter cftr1 and aquaporin subunit (aqp11), were among the predicted targets in gill. Collectively, these results indicate that the characterized gDEmiRNAs are essential post-transcriptional regulators that help FW-adapted parr successfully develop into SW-adapted smolts. The identification of gDE-miRNAs opens up for exploring these miRNAs as biomarkers. The altered expression of such gDE-miRNAs may potentially predict the smoltification status more precisely than the currently used biomarkers. The predicted miRNA targets revealed here need to be verified experimentally, and the gDEmiRNAs and their target genes need to be further studied to reveal the molecular details of this post-transcriptional regulation.

Smoltifisering er en kompleks utviklingsprosess som forbereder Atlantisk laks på overgangen fra ferskvann til sjøvann. Smoltifiseringsprosessen omfatter endringer i fiskens adferd og utseende, i tillegg til en rekke biokjemiske og fysiologiske egenskaper som forvandler en ferskvannstilpasset laksefisk (parr) til sjøvannstilpasset laksefisk (smolt). Vellykket smoltifisering er avgjørende for laksefiskens normale utvikling, vekst og helse i sjøfasen. I motsetning til dette bidrar ufullstendig smoltifisering til høyere dødelighet i den første tiden etter utsett i sjøen og øker risikoen for redusert utvikling, vekst og helse. Smoltifiseringsproblemer fortsetter å være en av de viktigste årsakene for dødelighet hos laks i settefiskfasen, noe som fører til store økonomiske tap for norsk oppdrettsnæring. MikroRNA (miRNA) er viktige posttranskripsjonelle regulatorer av genuttrykk som spiller kritisk rolle i biologiske prosesser. Målet med dette prosjektet var derfor å undersøke om noen av miRNA i Atlantisk laks er involvert i reguleringen av smoltifisering og sjøvannstilpasning, og å avdekke biologiske prosesser som sannsynligvis er kontrollert av disse spesielle miRNA. Studiene i denne avhandlingen benyttet high-throughput sekvensering og microarray analyser på tre hoved-organer (hodenyre, lever og gjeller) fra Atlantisk laks for å karakterisere miRNA og deres roller i gen-nettverk assosiert med smoltifisering og saltvannstilpasning etter sjøsetting. Fra high-throughput sekvenseringen ble det identifisert 62, 54 og 18 biologisk viktige miRNA som endret uttrykk (gDE-miRNA) i henholdsvis lever, hodenyre og gjeller. Microarray analyser av samme materialer identifiserte 5708, 2709 og 2382 mRNAs (budbringer-RNA) som endret uttrykk (DE-mRNA) i henholdsvis lever, hodenyre og gjeller. Prediksjonsanalysen viste at 2804, 1827, and 747 av DE-mRNA i henholdsvis lever, hodenyre og gjeller var regulert av gDE-miRNA (målgener). Genanrikningsanalyse av negativt korrelerte miRNA-mRNA-interaksjoner i hodenyre viste at de var assosiert med biologiske prosesser som syntese av hormoner, stress- og immunrespons og transport av ioner. Analysen av målgener i leveren og gjellene viste også en rekke viktige biologiske prosesser, inkludert karbohydrat- og lipidbiosyntese, aminosyre- og steroidermetabolisme, proteintransport, respons på ytre stimuli, immunsystem og ekstracellulær organisering. Viktige gener som er kjent for deres viktige funksjoner i smoltifiseringsprosessen som cyp1a1, nkaα1a, nkaα1b, and nkaβ, inkludert ion transporter cftr1 og aquaporin subunit (aqp11) var blant målgener. Resultatene indikerer at de identifiserte gDE-miRNA er viktige posttranskripsjonelle regulatorer som deltar i finjusteringen av de endringene nødvendig for forvandlingen av parr til smolt. Disse gDE-miRNA kan videre undersøkes med tanke på deres potensiale som nye biomarkører ettersom gDEmiRNA som viser endrende uttrykk kan potensielt forutsi smoltifiseringsstatusen bedre enn de nåværende biomarkørene. De predikerte proteinkodende gener som reguleres av gDE-miRNA må valideres med eksperimentelle metoder. Disse gDE-miRNA og deres målgener kan studeres videre for å avdekke deres rolle som posttranskripsjonelle regulatorer.