Significance of WRAP53 in breast cancer : mutation analyses and gene expression studies

Abstract

WRAP53 partly overlaps the neighboring gene TP53 in a head-to-head fashion. The WRAP53α isoform was identified as a natural antisense transcript to TP53, possessing regulatory functions involved in the induction of cellular p53 responses [1]. WRAP53 encodes as well a protein discovered as a telomerase holoenzyme subunit important for proper telomere synthesis [2]. WRAP53 overexpression is frequently observed in cancers, presuming WRAP53 as a gene implicated in cancer cell survival [3]. The overall aim of this thesis has been to investigate the significance of and increase the knowledge about WRAP53 in breast cancer. This was accomplished performing a WRAP53 mutation analysis and a gene expression study analyzing cellular responses to WRAP53 knockdown. The WRAP53 mutation analysis was performed sequencing all ten WRAP53 coding exons and start exon 1β in 175 primary breast carcinomas. Sequence alterations detected in tumor were verified in corresponding blood samples and investigated in relation to clinical, pathological and molecular parameters. The gene expression study was performed inducing siRNA-mediated WRAP53 depletion in the MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines. The gene expression alterations caused by WRAP53 knockdown were analyzed by microarray technology and related to biological functions including cellular pathways and disease states. No distinctive somatic alterations were detected in the WRAP53 mutation analysis, indicating that WRAP53 mutations do not seem to be a common event in breast tumorgenesis. Contrarily, the genetic linked polymorphic alterations, R68G, F150F and A522G, were significantly associated to breast cancer-specific survival and exon 1β c.–245 G>C was associated with nuclear WRAP53 protein localization, a feature of favorable prognostic impact. Together these results suggest that WRAP53 might be a marker of prognostic value in breast cancer. WRAP53 depletion altered the gene expression patterns in MCF-7 and MDA-MB-231. Despite cell line-specific outcomes in the pathway analyses, relating differentially expressed genes to biological functions, cancer and cancer-related features like cellular proliferation, growth and movement emerged as significant common denominators. The same was observed analyzing the mutual differentially expressed MCF-7 and MDA-MB-231 genes, supporting the hypothesis that WRAP53 might be involved in tumorgenesis.

WRAP53 og TP53 er delvis overlappende gener, og isoformen WRAP53α er identifisert som et naturlig antisens transkript til TP53 med regulatoriske funksjoner involvert i aktivering av cellulær p53-respons [1]. Proteinet WRAP53 koder for er identifisert som en subenhet i enzymkomplekset telomerase, og spiller en avgjørende rolle i telomersyntesen [2]. Overuttrykk av WRAP53 forekommer ofte i kreft og studier indikerer at WRAP53 er nødvendig for kreftcellenes overlevelse [3]. Hensikten med denne studien har vært å undersøke betydningen av og øke kunnskapsnivået om WRAP53 i brystkreft. Dette ble utført ved en WRAP53 mutasjonsanalyse og en genekspresjonsstudie for å studere cellulære responser av å slå ut WRAP53 (såkalt ”knockdown”). I mutasjonsanalysen ble de ti kodende WRAP53 exonene og start-exon 1β sekvensert i 175 primære brystkarsinomer. Sekvensvariasjon detektert i tumor ble validert i korresponderende blodprøver, og utforsket med hensyn til kliniske, patologiske og molekylære parametere. Ekspresjonsstudien ble utført ved siRNA-indusert WRAP53 knockdown i brystkreft cellelinjene MCF-7 og MDA-MB-231. Endringer i genuttrykk som følge av WRAP53 knockdown ble analysert ved hjelp av microarray teknologi og relatert til biologiske funksjoner som cellulære signalveier og patologiske tilstander. Ingen karakteristiske somatiske endringer ble påvist i mutasjonsanalysen, noe som indikerer at mutasjoner i WRAP53 trolig ikke er hyppig forekommende hendelser i brystkreft. De genetisk koblede polymorfiene, R68G, F150F og A522G, ble funnet signifikant assosiert med brystkreft-spesifikk overlevelse, og exon 1β c.–245 G>C ble assosiert med kjernelokalisering av WRAP53 proteinet, noe som bedrer prognosene ved brystkreft. Disse resultatene indikerer at WRAP53 kan være en markør med prognostisk verdi ved brystkreft. Knockdown av WRAP53 endret genuttrykket i MCF-7 og MDA-MB-231. Til tross for celletype-spesifikke resultater ved analysering av de signifikant endrede ekspresjonsnivåene i assosiasjon til biologiske funksjoner, ble kreft og kreft-relaterte karakteristikker som cellulær vekst, proliferasjon og bevegelse angitt som signifikante fellestrekk. Det samme ble observert ved analyse av gener med endret ekspresjonsnivå felles uttrykt i MCF-7 og MDA-MB-231, noe som støtter hypotesen om at WRAP53 kan være involvert i kreftutvikling.