Optimizing DNA Extraction from Dried Blood Spots for Biological Age Measurements

Abstract

While the chronological age is the time that has passed since birth, the biological age is determined by physiological signs of aging. Methylation at CpG sites has proven to be a promising biomarker of biological age, and epigenetic clocks have been developed to measure the biological age from methylation patterns. Age Labs is a molecular diagnostics company working on an epigenetic clock to predict risk of disease and all-cause mortality. Dried blood spots (DBS), capillary blood spotted on filter paper, is the preferred sample material as the patient can prepare the samples themselves, while the samples are stable at room temperature and can be sent by regular mail. The small volumes of blood typically spotted on the filter paper combined with the adhesion of DNA to the filter paper and the DNA input requirements for methylation assay makes it challenging to extract the DNA quantity needed. The aim of the study was to optimize an automatable and high throughput protocol for DNA extraction from DBS that yields DNA of sufficient quantity and quality for biological age measurements by methylation analysis. For the optimization process, DBS were prepared by an equal volume of EDTA blood. DNA extraction was optimized by first using spin columns to establish a baseline for the DNA extraction procedure. The potential of automating a high throughput method was then investigated by DNA purification on MagNA Pure 96 and with the Invitrogen PureLink® Pro 96 Genomic DNA Kit. The resulting optimized Invitrogen protocol was validated by biological age measurements with three different epigenetic clocks: DNAm age, DNAm GrimAge and Skin & blood clock, and the results were compared with those of a “gold standard” DNA extraction method. In this study, no statistically significant difference was found between the biological ages in DNA from capillary blood (DBS) extracted with the optimized Invitrogen protocol and DNA from venous blood extracted with a “gold standard” DNA extraction method. The results from the biological age measurements show that the DNA extracted from DBS with the optimized Invitrogen protocol yields DNA of sufficient quantity and quality for methylation analysis with the Infinium MethylationEPIC BeadChip. Furthermore, the optimized Invitrogen protocol is a high throughput DNA extraction method for DBS that can be fully or partially automated to decrease hands-on time.

Til forskjell fra kronologisk alder, som er tiden som har gått siden fødselen, er den biologiske alderen bestemt av fysioligiske aldringstegn. Metylering av CpG-områder har vist seg å være en lovende biomarkør for biologisk alder, og epigenetiske klokker har blitt utviklet for å måle biologisk alder ut ifra metyleringsmønstre. Age Labs er et molekylærdiagnostisk selskap som jobber med å utvikle en epigenetisk klokke for å forutsi sykdomsrisiko og generell dødelighet. Det foretrukne prøvematerialet er dried blood spots (DBS), kapillærblod avsatt på filterpapir, i og med at pasienten kan ta prøven selv, samtidig som prøven er holdbar i romtemperatur og kan sendes med vanlig postgang. Utfordringen med å ekstrahere den nødvendige mengden DNA fra dette prøvematerialet skyldes de typisk små blodvolumene og at DNA fester seg til filterpapiret, kombinert med mengden DNA som kreves for metyleringsanalyse. Målet for studien var å optimalisere en automatiserbar og høyeffektiv protokoll for DNA ekstraksjon fra DBS som gir DNA av tilstrekkelig mengde og kvalitet for måling av biologisk alder ved metyleringsanalyse. Til optimaliseringsdelen ble det laget DBS ved å bruke en kjent mengde EDTA-blod. Optimaliseringen av DNA ekstraksjonen ble først utført ved å bruke spinnkolonner for å etablere et referansepunkt for DNA-ekstraksjonen. Muligheten for å automatisere en høyeffektiv metode ble deretter undersøkt ved hjelp av DNA-rensing på MagNA Pure 96 og med Invitrogen PureLink® Pro 96 Genomic DNA Kit. Den resulterende optimaliserte Invitrogen-protokollen ble validert ved å måle biologisk alder ved hjelp av tre ulike epigenetiske klokker: DNAm age, DNAm GrimAge and Skin & blood clock. Resultatene ble så sammenlignet med resultatene fra en “gullstandard” DNA-ekstraksjonsmetode. Det ble ikke funnet noen statistisk signifikant forskjell mellom den biologiske alderen i DNA fra kapillærblod (DBS) ekstrahert med den optimaliserte Invitrogen-protokollen og den biologiske alderen i DNA fra venøst blod ekstrahert med en “gullstandard” DNA-ekstraksjonsmetode. Disse resultatene viser at DNA ekstrahert fra DBS med den optimaliserte Invitrogen-protokollen gir DNA av tilstrekkelig mengde og kvalitet for metyleringsanalyse med Infinium MethylationEPIC BeadChip. I tillegg er den optimaliserte Invitrogen-protokollen en høyeffektiv DNA-ekstraksjonsmetode for DBS som kan helt eller delvis automatiseres for å minimere mengden praktisk arbeid.